標題名稱:
免疫斑點影像分析儀篇
發佈日期:
2017-10-05
詳細內容:

免疫斑點影像分析儀篇

C.T.L  ELISPOT細胞激素檢測系統
C.T.L  ELISPOT Assays for Cells That Secrete Cytokines

ELISPOT(Enzyme-linked immunospot)最早是被發展來偵測分泌特定抗體的細胞,目前ELISPOT已經被廣泛用來偵測某些製造並分泌特定反應因子的細胞,這些反應因子包含細胞激素(Cytokine)、趨化激素(Chemokine)或是顆粒酵素(Granzyme)。這種技術測量細胞在被刺激後産生細胞激素的頻率,而此頻率的變化常常預示著治療和(或)病理的狀態,現已廣泛運用於歐美各大實驗室的疾病診斷和科學研究活動中,在國際上現在最熱門的細胞因子檢測方法。ELISPOT方法操作簡單,而且能提供非常類似於體內實驗的環境(ex vivo),對於測量週邊血或其中淋巴球的免疫功能而言,是一項功能強大的工具。

實驗原理

ELISPOT原理與ELISA相似,其全文為Enzyme-linked Immunospot Assay。本公司生物科學部研發出ELISPOT檢測試劑是在披覆PVDF膜的培養96微孔盤上,吸附上經純化、且無毒性(不含sodium azide、內毒素endotoxin)的抗體。當培養在微孔盤中的細胞被活化後,這些被固定且具特異性的抗體,可以捕獲細胞局部産生的細胞激素。微孔盤中的細胞被移除並清洗後,被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標記的二次抗體來標誌,其後再以結合酵素的Avidin與之作用,並加入酵素受質使其呈色,有反應作用的細胞留下約10-20mm大小染色的斑點。最後可以使用傳統方法以顯微鏡進行人工判讀,或使用高效能之影像分析系統(ELISPOT Plate Reader)進行判讀。斑點數目多寡及大小與細胞反應作用力有關,例如反應出免疫系統作用強弱。此法靈敏度極高,可用以檢測作用細胞數目,例如Th0/1/2/3、DC1/2、T1/2等。

實驗方法的改進

目前,由於96微孔盤使用材質及判讀機器的技術之長足改進,使得ELISPOT技術在使用及實用上更為方便,尤其是對於激素分泌細胞的快速定量,及針對每個細胞所分泌激素量相對比較的應用上更為顯著。PVDF膜材質的運用使得ELISPOT在分析斑點時,可以大幅增加訊號相對於雜訊的比例。PVDF膜相較於傳統的吸收膜有著更優越的捕捉能力;同時,以電腦輔助的影像收集及使用ELISPOT的專用分析軟體,可以大幅地增強ELISPOT技術,使其可以在短時間內客觀並準確地處理大量的實驗數據。

如何詮釋數據?

免疫學研究人員可以使用傳統的顯微鏡計算斑點數,或是使用ImmunoSpot® Analyzer自動分析儀。在分析ELISPOT實驗數據的過程中,ImmunoSpot® Analyzer先以高解析度鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像,而後儲存成TIF檔或是壓縮成JPEG檔;這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數目,如果使用ImmuneSpot分析軟體,可以先設定條件,然後同時分析斑點的大小,以推估激素分泌的多寡。
 
ImmunoSpot® Analyzer經由美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Dr. Paul Lehmann教授研究開發,該研究團隊改善增強影像儀之分析能力,開發出全自動掃描分析平台,可以精確地評估細胞激素分泌細胞生產頻率、每個細胞分泌量、及辨別細胞激素為同源或是異源分泌。新型的分析儀及其軟體可以提供各種不同的數據格式,包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數目、每個小孔中的平均斑點數目、每個小孔中斑點大小的直方統計圖。此一全自動掃描分析平台,克服傳統顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點,解除了ELISPOT分析技術的瓶頸問題。本公司生物科學部與美國俄亥俄卅CTL Analyzers公司合作,將在近期推出一系列自動分析儀,本公司同時提供完整、全新的ELISPOT試劑組套,希望促使ELISPOT技術得以全面推廣。

單一細胞等級高通量快速篩選

目前為止,以目視法判讀少量細胞族群的特性,如激活T細胞之激素分泌,仍被視為是免疫學技術上的一大挑戰;由於缺乏直接測量T細胞分泌激素的方法,阻礙了免疫疾病研究及治療的進展,例如過敏、自動免疫疾病、癌症、移植及傳染性疾病或其疫苗在臨床試驗之研究,ELISPOT技術輔以影像自動分析,被認為是提供上述研究訊息靈敏度高且快速大量的解決方法,ELISPOT除了高靈敏度及快速偵測的優點,這項技術同時具有大量分析、細胞需求量小以及可以分析冷凍保存的淋巴球等優點。

ELISPOT應用範圍

  • Ÿ移植研究 – allograft rejection
  • Ÿ疫苗開發 – 亦可評估疫苗效力,或是疫苗注射路徑影響
  • ŸTh0/Th1/Th2細胞轉換分析
  • 自體免疫研究 – 免疫調節及免疫治療研究
  • 癌症研究 – 腫瘤反應T細胞作用
  • 過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換,其他參與過敏機制之細胞激素研究
  • 傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
  • 抗原決定位定圖
  • 體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究